ในการทำ PCR ภายในหลอดทดลองมีอะไรเป็นส่วนประกอบบ้าง

เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม เป็นเครื่องมือวิทยาศาสตร์ที่มีในห้องปฏิบัติการที่ทำงานเกี่ยวข้องกับ DNA โดยเป็นเครื่องมือที่ใช้ประกอบกับเทคนิค PCR ในการเพิ่มปริมาณ DNA ขึ้นในหลอดทดลอง การรู้ถึงหลักการของเครื่องมือ วิธีการใช้งานอย่างถูกต้อง จะทำให้ผลการทดลองหรืองานวิจัยนั้นมีความน่าเชื่อถือ

เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม เป็นเครื่องมือวิทยาศาสตร์ที่มีในห้องปฏิบัติการที่ทำงานเกี่ยวข้องกับ DNA ลักษณะของเครื่องเหมือนหม้อหุงข้าว เมื่อเปิดฝาออกภายในมีหลุมสำหรับใส่ตัวอย่าง ขนาด 0.2 ml จำนวน 48-96 หลุม (ตามคุณสมบัติของแต่ละเครื่อง) เครื่องนี้มีความสามารถในการปรับเปลี่ยนอุณหภูมิร้อนและเย็น และในแต่ละช่วงอุณหภูมินั้นสามารถตั้งเวลาได้ การทำงานจะเปลี่ยนอุณหภูมิ ระยะเวลา ตามโปรแกรมที่ตั้งไว้ หมุนเวียนกันไปนับเป็นจำนวนรอบ โดยในช่วงอุณหภูมิและระยะเวลาที่แตกต่างกันจะส่งผลต่อตัวอย่าง DNA ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงขึ้นในหลายลักษณะ เทคนิคที่ใช้ในการเพิ่มปริมาณ DNA ขึ้นในหลอดทดลอง เรียกว่าเทคนิคพีซีอาร์ หรือ polymerase chain reaction เทคนิคนี้จะเพิ่มปริมาณ DNA ขึ้นโดยอาศัยหลักการการจำลองตัวเอง ในธรรมชาติ DNA จะอยู่เป็นสายคู่บิดเกลียววนขวา ประกอบด้วยเบส A T C และ G การเพิ่มปริมาณ DNA ในหลอดทดลองจะมี 3 ขั้นตอนคือ

1)      Denaturation เป็นการแยกสายดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบจากสภาพที่เป็นเส้นคู่ให้เป็นเส้นเดี่ยวโดยใช้อุณหภูมิในช่วง 92-95 องศาเซลเซียส

2)      Annealing เป็นขั้นตอนที่ลดอุณหภูมิลงอยู่ในช่วง 50-60 องศาเซลเซียส และใช้ไพรเมอร์ซึ่งเป็นดีเอ็นเอสายสั้น ๆ (ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์จำนวน 17-24 เบส) ที่มีลำดับเบสเป็นเข้าคู่กับสายดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบจับคู่กัน

3)      Extension เป็นขั้นตอนการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่โดยสังเคราะห์ต่อจากส่วนปลายของไพรเมอร์ (ที่ใส่เข้าไปในขั้นที่สอง) ตามข้อมูลบนดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบแต่ละสายโดยอาศัยการทำงานของเอ็นไซม์ดีเอ็นเอโพลิเมอร์เรส (DNA polymerase) ซึ่งเอนไซม์นี้ทำงานได้ดีที่สุดที่อุณหภูมิ 72-75 องศาเซลเซียส

การทำ PCR ขั้นตอนที่ 1 ถึง 3 นับเป็นจำนวน 1 รอบ ให้ผลผลิตเป็นดีเอ็นเอสายคู่ที่มีลำดับเบสเป็นคู่สมกับดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบ เพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า และเมื่อทำ PCR ขั้นตอนที่ 1 ถึง 3 หมุนเวียนไปอีกหลาย ๆ รอบ ปริมาณดีเอ็นเอจะเพิ่มขึ้นได้หลายเท่าทวีคูณ กล่าวคือปริมาณ DNA จะเพิ่มตามจำนวนรอบในการทำ PCR โดยปริมาณ DNA จะเท่า 2n เมื่อ n เท่ากับจำนวนรอบ

เทคนิค PCR นี้สามารนำไปใช้ประโยชน์ในการวิจัยด้านต่างๆ เช่นทางการแพทย์ ใช้ในการวินิจฉัยโรคต่าง ๆ ทั้งโรคติดเชื้อและโรคจากพันธุกรรม ได้แก่ การตรวจหาเชื้อไวรัสหรือแบคทีเรียที่เป็นสาเหตุของโรค ทำให้การวินิจฉัยโรคเพื่อป้องกันและรักษาเป็นไปอย่างมีประสิทธิภาพมากยิ่งขึ้น ทางการเกษตร มีประโยชน์ต่อการตรวจวินิจฉัยโรคพืช การตรวจสอบสายพันธุ์พืช นอกจากนี้แล้วเทคนิคพีซีอาร์ ยังช่วยให้เข้าใจพันธุกรรมของเชื้อโรคพืช ตลอดจนการนำไปใช้ในการป้องกันกำจัดโรคพืชที่เกิดจากเชื้อรา แบคทีเรีย และไวรัส หรือเชื้อสาเหตุโรคอื่น ๆ

         Amplification คือ ปฏิกิริยาการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอชนิดใดชนิดหนึ่งในหลอดทดลอง ให้มีจำนวนมากภายในระยะเวลาอันสั้น โดยอาศัยหลักการแบบเดียวกันกับการสังเคราะห์ดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิตตามธรรมชาติ แต่เดิมการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอจะทำในเซลล์ของสิ่งมีชีวิตโดยอาศัยกลไกที่เกิดขึ้นภายในเซลล์ซึ่งใช้เวลานาน ดังนั้นจึงมีการคิดค้นเทคนิคที่ช่วยย่นระยะเวลานี้ลง เราเรียกเทคนิคนี้ว่า Polymerase chain reaction (PCR)

องค์ประกอบหลักของ PCR มีดังนี้

1. ดีเอ็นเอต้นแบบ (DNA template)

             คือ ดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตที่มีส่วนของสายดีเอ็นเอหรือยีนที่ต้องการศึกษา โดยสกัดมาจากเนื้อเยื่อหรือเซลล์สิ่งมีชีวิต ซึ่งปัจจัยที่มีผลต่อประสิทธิภาพการทำปฏิกิริยา PCR ได้แก่ ความบริสุทธิและความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอที่สกัด และปริมาณดีเอ็นเอต้นแบบที่เหมาะสมเพียงพอต่อการทำปฏิกิริยา

2. ไพรเมอร์ (primer)

             คือ ดีเอ็นเอสายสั้นๆ (oligonucleotides) ที่มีลำดับเบสคู่สม (complementary) กับดีเอ็นเอต้นแบบ สังเคราะห์ด้วยเครื่อง DNA oligonucleotide synthesizer สามารถสั่งซื้อไพรเมอร์กับบริษัทที่รับสังเคราะห์ได้โดยราคาจะคิดตามจำนวนเบส

          โดยไพรเมอร์จะมีอย่างน้อยจำนวน 1 คู่ ได้แก่ forward primer และ reverse primer โดยทั้งคู่จะครอบคลุมตำแหน่งดีเอ็นเอที่สนใจศึกษา โดย forward primer จะถูกออกแบบแล้วจับกับดีเอ็นเอต้นแบบในทิศทาง (3’-> 5’) หรือ anti-sense strand ส่วน reverse primer จะถูกออกแบบในทิศทาง เป็นทิศทางสวนกลับ โดยจะจับกับดีเอ็นเอต้นแบบในทิศทาง (5’-> 3’) หรือ sense strand ดังนั้นการออกแบบไพรเมอร์ต้องมีความจำเพาะเจาะจงต่อดีเอ็นเอต้นแบบ ไม่ให้เกิด primer dimer คือการที่ไพรเมอร์ทั้งสองสายมีลำดับเบสคู่สมจับกันเอง และหลีกเลี่ยงลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ทำให้ไพรเมอร์จับตัวเอง (Self-complementary) หรือการเกิด hair pin loop

             ปัจจุบันจะมีการใส่ไพรเมอร์หลายคู่ในการทำ PCR หรือที่เรียกว่า multiplex PCR ทำให้มีขนาด DNA ที่แตกต่างกันในหลอดทดลองเดียวกัน

3. Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs)

             คือ นิวคลีโอไทด์ที่ประกอบด้วย 4 ชนิด คือ dATP, dTTP, dGTP, dCTP ทำหน้าที่เป็นวัตถุดิบการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่

4. เอนไซม์ DNA polymerase

        เป็นเอนไซม์ที่ทำหน้าที่ในการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่ โดยจะมีการเติมนิวคลีโอไทด์ทางด้าน 3’ ของดีเอ็นเอ ซึ่งในปฏิกิริยา PCR ขั้นตอนนี้จะมีการใช้อุณหภูมิที่สูง ทำให้ต้องใช้เอนไซม์ที่ทนต่อความร้อนได้สูงโดยไม่มีการเสียสภาพ ปัจจุบันจึงนิยมใช้เอนไซม์ที่สกัดได้จากแบคทีเรียที่ทนความร้อน คือ Thermus aquaticus เป็นแบคทีเรียที่อาศัยตามบ่อน้ำพุร้อน เอนไซม์ที่ได้จะเรียกว่า Taq DNA polymerase

              เอนไซม์จะต้องเก็บในที่อุณหภูมิ -20 °C เพื่อป้องกันการเสื่อมสภาพ ขณะนำออกมาทำ PCR ควรนำออกมาใช้ภายนอกตู้เย็นให้น้อยครั้ง และต้องแช่ในน้ำแข็งตลอดเวลา PCR buffer

5. Magnesium ion (Mg2+)

            เป็นส่วนประกอบสำคัญสำหรับปฏิกิริยา PCR ทำหน้าที่เป็น co-factor ช่วยในการทำงานของเอนไซม์ DNA polymerase ในการสร้างสายดีเอ็นเอ และช่วยในการจับกันของดีเอ็นเอต้นแบบและดีเอ็นเอที่สร้างใหม่ ความเข้นข้นของ Mg2+ เป็นปัจจัยสำคัญที่มีผลต่อการปฏิกิริยา PCR หากมีความเข้นข้นมากเกินไปจะทำให้เกิดผลผลิต PCR ที่ไม่จำเพาะ หรือถ้าน้อยเกินไปจะทำให้ปริมาณผลผลิต PCR น้อย

6. Buffer

              เป็นสารละลายที่ช่วยในการรักษาค่า pH ให้เหมาะสมในปฏิกิริยา PCR

7. เครื่อง Thermo cycler

              เครื่องมือสำหรับการทำ PCR โดยมีโปรแกรมที่สามารถปรับเปลี่ยนอุณหภูมิได้ตามที่ต้องการ

ขั้นตอนการทำ PCR

1. Denaturation

        เป็นขั้นตอนการแยกสายดีเอ็นเอต้นแบบจากดีเอ็นเอสองสายที่มีเบสคู่สมจับกันพันเป็นเกลียวคู่ (double strand DNA; dsDNA) ออกจากกันเป็นดีเอ็นเอสายเดี่ยว (single strand DNA; ssDNA) โดยการใช้ความร้อนที่อุณหภูมิสูงประมาณ 90-95 °C ในการทำลายพันธะไฮโดรเจน ซึ่งดีเอ็นเอสายเดี่ยวนี้จะเป็นต้นแบบการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่

             อุณหภูมิและเวลาที่ใช้ในขั้นตอนนี้มีผลต่อผลผลิต PCR หากใช้อุณหภูมิที่สูงเป็นเวลานานอาจทำให้ดีเอ็นเอและเอนไซม์เสียสภาพ หรือหากใช้อุณหภูมิที่ต่ำเกินไปจะทำให้เกลียวดีเอ็นเอแยกออกจากกันได้ไม่ดีทำให้ปริมาณผลผลิต PCR น้อยลง

2. Annealing

             มีการลดอุณหภูมิลงให้อยู่ในช่วง 50-66 °C ขึ้นอยู่กับตำแหน่งดีเอ็นเอและ Melting temperature (Tm) ของ primers เพื่อที่ไพรเมอร์จะเข้าจับกับดีเอ็นเอสายเดี่ยวที่ได้จากการแยกสายดีเอ็นเอต้นแบบในขั้นตอน Denaturation ในบริเวณที่เป็นเบสคู่สมกัน (complementary) ได้อย่างจำเพาะ

3. Extension

            เป็นขั้นตอนที่มีการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ต่อจากไพรเมอร์ที่จับกับดีเอ็นเอต้นแบบ โดยการเชื่อมต่อนิวคลีโอไทด์ (dNTPs) ในทิศทางจาก 5' ไป 3' โดยทั่วไป Taq DNA polymerase จะทำงานได้ในอุณหภูมิที่เหมาะสมประมาณ 70-72°C

              เมื่อทำครบทั้ง 3 ขั้นตอน ถือเป็นการทำ 1 รอบปฏิกิริยา PCR ซึ่งโดยทั่วไปจะทำปฏิกิริยาประมาณ 30-40 รอบ ดังนั้นปริมาณดีเอ็นเอจะเพิ่มขึ้น 2n (n = จำนวนรอบที่ใช้ในปฏิกิริยา PCR)

ผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้องสำหรับการทำ PCR

- PCR

- cDNA Synthesis & RT-PCR

- LAMP & Isothermal Amplification

- PCR Accessory Reagents

ข้อมูลผลิตภัณฑ์เพิ่มเติม : https://www.lucigen.com/PCR-and-Amplification/

อ้างอิง :

- อำไพวรรณ จวนสัมฤทธิ์ และคณะ (2534) “ความรู้พื้นฐานเรื่องเวชพันธุศาสตร์ II Polymerase Chain Reaction (http://www.tsh.or.th/file_upload/files/v1%20n4%20469.pdf)